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人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)ELISA试剂盒

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  • 更新日期:2012-06-18 11:57
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详细介绍
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人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)ELISA试剂盒
原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 GDNF 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 GDNF与单抗结合,加入生物素化的抗人GDNF,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,GDNF浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中GDNF浓度。
试剂盒组成2-8保存)
酶标板(Coated Wells)
96孔
酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate)
12ml
10×标本稀释液(Sample Buffer)
12ml
20×浓缩洗涤液(Wash Buffer)
50ml
标准品(Standards):4ng/瓶
2瓶
底物工作液(TMB Solution)
12ml
第一抗体工作液(Biotinylated Antibody)
12ml
终止液(Stop Solution)
12ml
准备试剂与收集血样
1.          收集标本:血清、血浆(EDTA)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8保存48小时;更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存,避免反复冻融。标本可能需要稀释,请预先做预实验,以确定稀释倍数。
2.          标准品液配制:使用前加入1ml蒸馏水混匀,配成4000pg/ml的溶液。设标准管8管,每管加入标本稀释液300ul。在第一管中加入4000pg/ml的标准品溶液300ul混匀后用加样器吸出300ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出300ul弃去。第八管为空白对照。
3.          10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。
4.         洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)
检测程序
1.          加样:每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.          洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
3.          每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4.          洗板:同前。
5.          每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6.          洗板:同前。
7.          每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应15分钟。
8.          每孔加入100ul终止液混匀。
9.          30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断
1.          所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.          以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。
3.          根据样品OD值在该曲线图上查出相应GDNF含量,再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能
             1.   灵敏度:最小的GDNF 检测浓度小于15pg/ml。
2.        特异性:可同时检测重组或天然的人GDNF。不与人其它细胞因子有交叉反应。
3.        重复性:板内、板见变异系数均小于8.9%。
注意事项
             1.   以上标准孔及待测样品均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线。
 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。
             3.   板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥
             4.   本试剂盒宜置4oC冰箱保存。
 5.   本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!
 
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