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草鱼鱼肉总蛋白质凝胶电泳新技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2011-03-09  来源:生物通  浏览次数:2726
核心提示:凝胶电泳,虽是一项看似不起眼的技术,却也蕴藏着不少学问。如果你总结出了一些电泳技巧和经验,或者对核酸电泳/蛋白电泳有一些特别的心得体会,那么你就是我们要寻找的“电泳达人”啦。
    凝胶电泳,虽是一项看似不起眼的技术,却也蕴藏着不少学问。如果你总结出了一些电泳技巧和经验,或者对核酸电泳/蛋白电泳有一些特别的心得体会,那么你就是我们要寻找的“电泳达人”啦。

长沙理工大学的王满生介绍了草鱼鱼肉总蛋白凝胶电泳的详细步骤。
1.凝胶电泳的总蛋白提取
根据Wasson等的方法稍作改进提取总蛋白。取40ml含有0.1%β-巯基乙醇的5%SDS溶液添加到6g搅碎的鱼肉中,然后用绞肉机绞碎3次,每次10s,然后无损转移到离心杯中(期间用另外10ml上述SDS溶液淋洗绞肉杯);再于80℃水浴1h ,尽量使所有的肌原纤维蛋白完全溶解,最后在8000r/min离心20min,上清液过滤去除脂类等物质,并用Lowry法测定上清液中蛋白质的含量。
2.SDS-PAGE凝胶电泳
(1)标准蛋白标准曲线制作
SDS-PAGE主要依据就是各蛋白质分子量的差异。因为当SDS与蛋白质结合后,蛋白质分子就会带有大量负电荷,并远远超过其原有的电荷,从而使天然蛋白质分子间的电荷差降低甚至消除。与此同时,蛋白质在SDS作用下,结构变得疏松,形状趋向一致,此时根据各种SDS-蛋白质复合物在电泳时所产生泳动率差异即可说明分子量差异。
用直尺分别量出标准蛋白质及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离,按下式计算相对迁移率:
相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
计算结果如下:
染料迁移距离(cm)
样品迁移距离(cm)
相对迁移率
标准蛋白
名称
标准蛋白
分子量Mr
对数分子量
Low MW
5.5
4.6
0.8364
鸡蛋清溶菌酶
14400
4.1584
5.5
3.9
0.7091
胰蛋白酶抑制剂
20100
4.3032
5.5
2.8
0.5091
牛碳酸酐酶
31000
4.4914
5.5
2.1
0.3818
兔肌动蛋白
43000
4.6335
5.5
1.2
0.2182
牛血清白蛋白
66200
4.8209
5.5
0.8
0.1455
兔磷酸化酶B
97400
4.9886
以标准蛋白质分子量Mr的对数对相对迁移率作图,得到标准曲线如下:
(2)鱼肉样品提取液SDS-PAGE凝胶电泳
一) 实验试剂的配制
 (1) 10%(W/V)SDS溶液:称5克SDS,加纯净水至50ml,使其充分溶解;
天气冷时稍微预热,可加快溶解。
(2) 10%(W/V)过硫酸铵(AP):称取AP1克,加重蒸水至10ml。临用前配制,即现配现用。注意,称样时先将表面的药品层刮去,选择里层样品取样称量。
(3) 凝胶贮液
A液:
称取丙烯酰胺29.2克,甲叉双丙烯酰胺0.8克,溶于重蒸水中,最后定容至100ml,缓慢搅拌至丙烯酰胺粉末完全溶解,过滤后置棕色瓶中在4℃保存。注意,所用试剂需要达到电泳级别纯度,进口试剂好些。
B液(100ml):
75ml 2mol/L Tris-HCl(PH8.8)
4ml  10%SDS
21ml 纯净水
置棕色瓶中4℃保存。
C液(100ml):
   50ml  1mol/L Tris-HCl(PH6.8)
   4ml   10%SDS
   46ml  纯净水
置棕色瓶中4℃保存。
(4) 电极缓冲液(内含0.1% SDS,0.05 mol/L Tris-0.384 mol/L甘氨酸缓冲液 pH8.3)称Tris3.0克,甘氨酸14.4克,加入10%SDS 10ml,加重蒸水约900ml使其溶解,调pH8.3后定容至1000ml,置4℃保存。
(5) 固定液:量取50%的甲醇454 ml,冰乙酸46ml混匀。
(6) 染色液:称考马斯亮蓝R-250 0.125克,加上述固定液250ml,充分溶解后过滤备用。
(7) 脱色液:冰乙酸75ml,加蒸馏水定容至1000ml。
二)样品制备
(1) 5×样品缓冲液的配制:按下表配制50ml
10%SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 甘油 1mol/L Tris-HCl 加水至总体积为
10ml 2.5ml 0.25g 30ml 3ml 50ml
(2) 鱼肉提取液样品处理
吸取1ml鱼肉提取液,加1ml5×样品缓冲液,再加3ml纯净水,水浴10分钟,然后于12000rpm离心5min,取上清液准备上样。
三) 实验操作方法
① 原位制胶器的安装
② 凝胶板的制备
⑴ 分离胶的制备:按下面的配方比例配制15ml 12.5%分离胶,加AP混匀后用细长头滴管将凝胶液加至平、凹玻璃板间的缝隙内,约灌至胶室的2/3处位置时,用1ml注射器取少许蒸馏水,沿平玻璃板板壁缓慢注入,约1cm高,以便除去气泡和隔氧,置于35℃培养箱中保温。约40min后,凝胶与水封层间出现折射率不同的界线,则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水,再用滤纸条吸去多余水分。
分离胶配方:
A液    6.3ml
B液    3.75ml
纯净水  4.95ml
10%AP  50微升
TEMEP  5微升
AP用量根据室温酌情添加。
⑵ 浓缩胶的制备:按下面的配方比例配制8ml5%的浓缩胶,用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方,直至距离凹玻璃板上端约0.5cm处,轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内,置于35℃培养箱中保温,约30min后凝胶聚合,再过20-30min使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板,用窄条滤纸吸去槽内多余水分。
浓缩胶配方:
A液    1.34ml
C液    2.00ml
纯净水  4.60ml
10%AP  30微升
TEMEP  5微升
AP用量根据室温酌情添加。
③加电极缓冲液及上样
先在外室加入适量的电极缓冲液,然后倾斜电泳槽,以赶走分离胶底部残留的气泡;再往内室加电极缓冲液,直至缓冲液进入上样孔内。丄样时不要让枪头触及凝胶,且每上一种样品后都要换一只枪头,再上另外一种样品。而且空的上样孔里面也都加入上样缓冲液。
④电泳
⑴ 将上盖盖在下槽(缓冲液槽)上,并使其完全扣紧到位。
⑵ 接通电泳仪电源,开始稳压为40V左右,待样品进入分离胶后改为80V,当染料前沿距橡胶框底边0.5cm左右时,停止电泳。
⑤ 凝胶板剥离与固定
电泳结束后,取下凝胶模,卸下橡胶框,用镊子撬开凹玻璃板,在凝胶板上切下一角作为加样标志。在两侧溴酚蓝染料区带中心插入细铜丝作为前沿标记,将凝胶板放入带盖的大培养皿内,加入固定液,固定2h。
⑥ 染色与脱色
倾去固定液,将染色液倒入培养皿内染色2小时左右,用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,期间不时振摇培养皿,同时更换脱色液数次,直至蛋白质区带清晰为止,有时可能要过夜脱色。
⑦ 照相并分析结果
四)实验结果与分析
如下电泳图谱,其中从左边第一泳道到第六泳道分别是鱼肉在常温(25℃)条件下保存不同时间的电泳条带,第七泳道为蛋白质标样的电泳条带。
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关键字:草鱼鱼肉 总蛋白质 凝胶电泳
 
 
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