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猪肉二噁英检测技术总汇

放大字体  缩小字体 发布日期:2008-12-11  来源:生技网信息中心  浏览次数:2222
核心提示:最早报道用于二恶英检测的方法是Adams等人于1941年使用的大白兔皮肤检测,他们将2,3,7,8- TCDD涂布于大白兔内耳皮肤,然后观察它

最早报道用于二恶英检测的方法是Adams等人于1941年使用的大白兔皮肤检测,他们将2,3,7,8- TCDD涂布于大白兔内耳皮肤,然后观察它们的肿快和炎症反应。随后Jones&Krizek于1962年发展了该法,他们是观察使用样品后大白兔耳朵角蛋白形成的恢复和角蛋白的重量。很明显这种方法是非特异性的,并且不能够检测低剂量的样品。于20世纪60~70年代起人们开始使用气相色谱测定实际样本中的二恶英类物质,对二恶英的监测获得了极大的改进。不久又出现了免疫学和生物学方面的方法。

至目前二恶英类化学物质检测方法的研究主要集中于色谱法、免疫法和生物检测法三大类,其余方法的由于检测限或特异性等原因在实际中没有得到广泛的应用。

色谱法

用色谱学方法检测二恶英类化学物质首先需进行样本中待分析物的提取和净化,这是由于分析物在样本中含量低(ppt级),超痕量分析很容易受基质中其它成分的影响。然后色谱柱的分离,并联用检测器进行定性、定量。下面将分别介绍以上各步。


提取 这步目的在于使待测物游离,并萃取进入用于抽提的溶剂中。该步对于检测的重复性至关重要,主要是溶剂的选择和提取方法的选择,且不同的样本需采用不同的提取方法。对于土壤、灰尘等样本使用溶剂有甲苯、乙烷、二氯甲烷、二氯甲烷和丙酮混合液(1:1体积比)、二氯甲烷和丙烷混合液(1:1体积比)、苯,提取时间为12~60小时。并且通常采用索氏抽提,Hengstmann等曾研究采用超音速索氏抽提(supersonic Soxhlet extraction),超临界流体抽提(supercritical fluid extraction)也已使用,Barnabas对此进行了详细综述。对生物样本一般是在冰冻后与无水硫酸钠共同研磨去除水分,然后再采用合适的溶剂提取。常用溶剂有:轻石油-丙酮-乙烷-二乙基乙醚(18:10:5:2体积比)、丙酮-乙烷(1:1体积比)、丙酮-戊烷(3:7体积比)、丙请、二氯甲烷和乙烷混合液(1:1体积比)、氯仿-甲醇-乙烷混合液(1:1:1体积比)。其中二氯甲烷和乙烷混合液用于血样,丙请和氯仿-甲醇-乙烷混合液用于奶样,其余用于脂肪和肌肉组织。血样提取前常添加乙醇和硫酸铵饱和溶液,然后再抽提。奶样则先用甲酸处理。生物样本提取方法,除血样和奶样是于室温下振荡提取外,其它样品一般用Dean Stark的仪器进行索氏抽提。水样中二恶英的抽提一般使用二氯甲烷和甲苯,于索氏抽提器中抽提24小时。水中多氯联  苯的提取方法主要有三种:(1)使用有机溶剂液-液萃取;(2)使用填充柱吸附;(3)碱性水溶液分解-水蒸气蒸馏法。常用溶剂有正己烷和二氯甲烷,常用吸附剂有活性碳、石墨、高分子大口径网状吸附树脂(尤其是美国的XAD系列),常用洗脱剂有乙醚、甲醇、二氯甲烷、甲酮、二甲基亚砜。对空气样本在采样后,用以下有机溶剂进行洗脱抽提,主要为:丙酮、甲苯、苯、二氯甲烷。对于植物样本首先冰冻脱水,然后在适当有机溶剂作用下微波消化,常用溶剂为:二氯甲烷、甲苯-丙酮(1:1体积比)、甲苯-乙醇(3:1体积比)。所有样本提取后的有机溶剂在进行净化前,都要浓缩以利于下一步操作。


净化 经过抽提步骤多氯代二苯并二恶英/呋喃和多氯联苯绝大部分进入了提取液中,但同时进入的还包括有机农药、脂肪物质、多环芳烃、叶绿素等,这些物质的存在会干扰二恶英类物质的检测,因此必须进行净化去除干扰物质。用于净化的方法主要有以下方法:液-液分配、浓硫酸磺化、碱解、氧化、柱层析(包括凝胶色谱和液相色谱)。净化方法的选择主要依靠于样本的类型、抽提溶剂的种类等。液-液分配只能去除部分杂质,经酸/碱处理的样品,通过己烷处理可去除部分杂质;经有机溶剂处理的样品在碱性溶液中分配可去除酸性杂质,但碱处理时间不能太长否则二恶英会分解;经有机溶剂提取的样本用浓硫酸磺化,可去除脂肪、色素等杂质。柱层析往往采取几根层析柱串联或多种填料填充柱的方法,目前主要采用两种方法相结合的方法,即采用两根多种填料填充柱。其中第一根柱由上至下依次填充硅酸钾、硅胶、硅酸钾或硅酸铯、硅胶、活性碳,第二根采用串联柱依次填充硅酸钾或硅酸铯、硫酸饱和硅胶、活性氧化铝[72]。但是填充柱使用的填料及组合方式多样,有数十种。佛罗里达毛细管柱(130度激活)可将共平面多氯联苯、多氯代二苯并二恶英/呋喃和非共平面多氯联苯分别开来。佛罗里达柱依次用乙烷和二氯甲烷洗脱,收集洗脱液,第一部分为非共平面多氯联苯,第二部分则包括共平面多氯联苯、多氯代二苯并二恶英/呋喃可用于分析。最近有发展了三种将共平面多氯联苯与多氯代二苯并二恶英/呋喃分离的吸附剂,(1)多孔石墨碳,(2)2-(1-芘基)-乙烷基甲基silylated硅胶,(3)C60/V70fullerenes bonded to polystyrene-divinylbenzene(聚苯乙烯-二乙烯基苯)。这三种吸附剂具有相同的洗脱特性,所须洗脱剂少。但这三种吸附剂比较昂贵,样本容量小,并且要求所进样品不含脂质和其它共存物。使用高效液相色谱来净化抽提物是近几年才发展起来的,并且也有用薄层色谱来净化提取物的。


测定 二恶英类化学物质的测定采用过高效液相色谱、高效薄层色谱和气相色谱,其中气相色谱技术远优于另外两者。所用的气相色谱柱包括填充柱和毛细管柱,毛细管柱以其所需样品少、柱效高已逐渐取代了填充柱。普通填充柱内径为2~6mm,柱长1~3m,柱容量大,但精密度及灵敏度不行。毛细管柱长一般25~60 m,内径为0.20~0.32 mm,涂层厚度为0.15~0.33 μm,以前多使用不锈刚和玻璃毛细管柱,现在以熔融石英为材料的毛细管柱正得到广泛使用。最近,SUPELCO公司推出了二恶英专用毛细管柱,它极性较强,能分离TCDDs,最高使用温度为275度。尽管人们近年来在分离上做了大量的工作,但想在一根柱上分离全部的异构体是不可能的。表1列出了色谱柱选择的一些标准。


  表1 色谱柱的选择


色谱柱的进样方式包括有冷柱头进样、程序升温进样以及在柱前用冷阱富集进样。


曾用于检测二恶英的检测器很多,包括有红外、紫外、X射线衍射、荧光、冷磷光、核磁共振、电子自旋共振、火焰离子化检测器、电子铺获检测器、原子激发检测器以及质谱仪。由于检测限的原因,目前主要使用的检测器是质谱仪,电子俘获检测器也有一定的应用。质谱仪使用的有低分辨率、中分辨率和高分辨率,电离方式有EI和NCI,但主要使用EI-SMI,因为使用SIM可减少基体的影响。目前串联质谱也得到了应用,它与高分辨率质谱仪比较有更好的选择性。有关气相色谱检测二恶英的具体条件及检测限等内容可见表2,表2仅是少部分例子,但绝大多数检测都是使用相同的毛细管柱、相同的升温程序和相同的检测器。


  表2 气相色谱检测二恶英的条件和检测限


定性:二恶英类化学物质的定性可根据与标准物质保留时间比较,一种方法是在相同条件下,标准物质与待测物质分别进样比较保留时间;另一种方法是标准物质和待测物质共同进样,根据峰高的增加而定性。这种定性方法要求有标准物质,而目前二恶英类化学物质的数百种物质中仍有一些没有标准物质,但那些毒性较大的都已有标准物质,如四氯代二苯并二恶英的22种同分异构体都有标准物质,可依此检测出毒性最大的2,3,7,8-四氯代二苯并二恶英。另外依靠标准物质定性在标准物质的来源及价格方面也必须有所考虑,尤其是在国内。因此依靠质谱定性是使用越来越多的种方法,质谱的定性可根据总离子流色谱图、质量色谱图和碎片色谱图等。


定量:二恶英的定量采用TEQ定量法:由于目前只有部分标样,因此定量时一般采取测定最毒的17种化合物,以代表全部的二恶英,即首先测定各分量,再乘以相应毒性当量因子,最终以TEQ的量来表示。目前较多的是以同位素为内标来定量,以同位素为内标定量准确,可对分析各步进行评价和控制,进行质量控制。


色谱学方法是目前国际公认的检测二恶英类化学物质的标准方法,尤其是高效毛细管色谱加高分辨率质谱(以选择性离子方式),其优点在于可以分离该类物质的每种成分,并进行准确的定量。但色谱学方法需要有复杂的样品前处理过程,通常需数天;并且要求有精密的仪器、良好的实验环境和训练有素的操作人员;用于定性和定量用的标准品也是必须的,但目前有些标准品还不具备;一般用色谱学方法检测一个二恶英样品耗时数周至一个月,花费800~1000美元。因此要在基层单位开展二恶英类化学物质的色谱学检测是不可能的,我国只有武汉中科院水生生物研究所和中国科学院环境化学研究所进行了这方面的工作。色谱法检测二恶英类化学物质虽然可以精确定量,但检测某样品的二恶英类化学物质含量,必须换算成总毒当量。而毒性等价因子的值则依观察终点的选择不同,其值不同,不利于比较。并且色谱法仅能反映样本的二恶英类化学物质总量,而不能反映其生物效应。

免疫学方法

由于色谱学方法的复杂及昂贵,因此一些较为快速简便的方法被发展,以满足环境监测需要。免疫学方法以其选择性好、灵敏度高,在很多方面得到了应用,自七十年代起人们也开始探索其在二恶英检测中的使用。1978年Philp等采用双抗体放射免疫分析检测了环境样品和生物样本中的多氯代二苯并二恶英,检测限为25pg。检测原理为碘125(I125)标记的二抗与二恶英竞争性地与一抗结合,然后检测沉淀物中放射性的减少而定量。检测使用的是多克隆抗体,抗体是使用1-氨基-3,7,8-三氯代二苯并二恶英与免疫原性蛋白(牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白)结合后,免疫新西兰大白兔得到。用于溶解待测物质的溶剂也是反应的关键之一,这是由于二恶英为疏水性,而抗原、抗体反应为水溶性反应,因此溶剂的选择是十分重要的。反应中用于溶解疏水性二恶英的溶剂是非离子去垢剂Cutscum和Triton。经过合适的净化程序,该过程主要的干扰物质为多氯代二苯并呋喃。

由于单克隆抗体技术的发展,在二恶英检测方面使用了单克隆抗体。在检测技术方面,出现了酶竞争性免疫分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)。1986年Stephen 等,使用I125标记单克隆抗体检测氯代二苯并二恶英,他们使用的抗体与牛血清白蛋白-TCDD结合的能力是与牛血清白蛋白-苯胺结合能力的200倍。并且他们采用固相免疫反应,大大缩短了检测时间。1987年Larry等检测了五种对多氯代二苯并二恶英/呋喃单克隆抗体的特异性。他们的研究表明,这五种抗体都能识别四和五氯代二苯并二恶英,而不能识别无、单、六、十氯代二苯并二恶英和无、十氯代二苯并呋喃及1,2,3,4,8,9-六氯代二苯并呋喃。对多氯联苯,仅有其中两个抗体可轻微识别3,3’,4,4’-四氯联苯。其中特异性最高的两个抗体,完全不与多氯联苯、五氯酚、2,4-二氯苯氧基乙酸、三氯酚、2,4,5-三氯苯氧基乙酸这些干扰物质反应。检测采用ELISA法,检测限为0.5ng。Nukio等以多克隆抗体,采用ELISA检测多氯代二苯并二恶英在最适条件下,检测限为240pg/mL,线性范围为40-4800 pg/mL。在检测中他们使用的溶剂是二甲基亚枫和甲醇。在共平面多氯联苯的免疫学分析方面,Ya-Wen Chiu等设计的单克隆抗体可识别含3,3’,4,4’-四氯取代的共平面同系物,检测限可达ppb级。

免疫学方法与色谱学方法在二恶英检测方面主要优势在于:(1)所需时间较短,通常检测过程仅需数个钟头;(2)操作较简单,包括样本前处理和检测过程,对检测人员要求相对较松;(3)检测样品的费用也较便宜。但免疫学方法抗体的获得不易,目前没有商品出售,并且制备也很复杂。由于抗体原因免疫学方法并不能检测所有的同系物,制备的抗体一般是针对毒性较大的几种。即使免疫学方法有不少缺陷,但由于其简便、快速,是大量样本筛选的较好方法,但该法也不能反映生物学效应。对免疫学方法的研究目前主要集中在抗体的制备和检测程序标准化方面。

生物学方法

二恶英类化学物质的生物学检测是依据二恶英类化学物质的毒性作用机理。二恶英类化学物质的毒性作用主要是通过与机体细胞内芳香烃受体相结合,然后结合物转移入细胞核与芳香烃受体核转位子蛋白结合,两者形成的复合物与胞内二恶英反应增强子作用,诱导特异基因的表达(主要是CYPIAI),导致毒性作用。由于二恶英与芳香烃受体接触的量与其诱导基因表达的能力在一定范围内成正比,因此可通过检测特异基因的表达产物来反映二恶英类化学物质的量。

通常使用的生物学标志物是芳烃羟化酶(AHH)和7-乙氧基-异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD),这两个酶都是CYPIAI的表达产物。并且已经有很多实验证实了不同二恶英同系物导致毒性的能力与它们诱导这两个酶的能力是成正比的。使用生物学方法检测二恶英类化学物质的程序为,将样本的抽提物与细胞共同培养数天,收集细胞、裂解细胞、离心收集上清用于检测酶活性。所得值与2,3,7,8-TCDD所制标准曲线比较,结果用TEQ值表示。AHH的检测原理是该酶可催化苯并芘生成3-羟基苯并芘,而3-羟基苯并芘为荧光物质,可通过荧光检测3-羟基苯并芘反映AHH的量。EROD的检测原理是,7-乙氧基-异吩恶唑酮和NADPH在氧气和EROD的参与下生成7-羟基-异吩恶唑酮(RF),RF为荧光物质。用于生物检测的细胞株,必须满足一定的条件:首先细胞中的芳香烃受体的含量需较高,只有这样二恶英类化学物质才能与细胞作用,达到较高的灵敏度;另外该细胞株对待诱导酶的本底表达必须低。常用的细胞株有:大鼠肝癌细胞株H4IIE、小鼠肝癌细胞株Hepa1、人类肝癌细胞株HepG2,尤其是H4IIE。最早使用该法的是美国食物和药品管理局,他们采用H4IIE细胞株,以异辛烷为溶剂提取淡水鱼中的二恶英,检测限为10pg。Thomas等对该检测方法进行了一定的改进,提高了检测速度,检测限达到了20pM。国内徐盈等应用EROD法检测了土壤中二恶英化合物,并与色谱法进行了比较,表明具有良好的相关性。

为了进一步提高检测的灵敏度,Aarts等构建了一在二恶英反应增强子调控下的荧光素酶报告质粒,他们将该质粒转染入对二恶英敏感的细胞后,用含报告质粒的细胞进行检测。与传统生物学方法比较,该法简化了操作,降低了本底,检测限可达2.4pM,并且由于可进一步用基因工程技术改进报告质粒可进一步提高灵敏度。Murk用该方法检测了底泥、水体和血浆样品,获得了良好效果。国内同济医科大学环境医学研究所在开展这方面的工作。EI-Fouly等还构建了一含碱性磷酸酶的报告质粒,但由于碱性磷酸酶为真核基因,在真核细胞中有较高表达,背景值大未能广泛应用。

生物学方法与色谱学方法比较,虽然不能检测二恶英类化学物质的各个成分,但它简便、快速、费用低,并且能更准确地反映二恶英类化学物质对机体的影响。这是由于二恶英类化学物质对细胞芳香烃受体的联合作用,不都是相加作用,还有协同和拮抗作用。因此生物学检测方法适合于大量样本的快速筛选和半定量测定。与免疫学方法比较,生物学方法能同时检测更多的样本,并且不需进行象抗体制备那样复杂的准备工作。

 
 
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