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实验室抗体如何挑选

日期:2016-05-25    点击:753    查看原图    全部展开









 
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 加州大学圣地亚哥分校的细胞生物学家Stephan Lange的论文手稿基本上都准备好了,这时他打算再检查核对一下他的抗体:Lange对缺失G蛋白偶联受体的小鼠样品进行染色,按道理说抗体不会出现信号。然而结果却是它显色了,Lange只好把他论文中基于抗体的这部分删去,而剩下的一部分却不足以吸引人了。

这令Lange失望极了,不过值得安慰的是,他并不是唯一一个有此体验的实验人员,抗体可以说是生物学实验室里最常用,也最容易出现问题的试剂,而且这种试剂还不便宜。Lange说,一般买来的抗体大约每100mg 200-500美元(当地价格),比黄金还贵(2016年1月的黄金价格为每克35.29美元)。而且有时这些“比黄金还贵的花销”还会打水漂,来自Mol Cell Proteomics杂志的一项研究指出,在被检测的5000种商用抗体中, 只有一半能在Western blotting和免疫组化实验中均有效,一些研究人员还认为问题抗体是许多科学研究无法重复的罪魁祸首。

为此越来越多的科学家希望能提出更高的抗体标准,全球生物标准研究所(Global Biological Standards Institute)由此制定了抗体验证准则和试剂操作手册。但单单是这些并不够,研究所主席Leonard Freedman指出,这还需要多方合作,比如杂志拒绝低标准验证抗体发表论文,资助机构拒绝为可疑试剂提供资金等等。事实上,今年美国NIH将会要求基金申请人验证他们使用的抗体,虽然目前还不影响评分。


一些制造和出售抗体的公司也在尝试梳理其产品目录,执行更严格的验证检测,提高其试剂的公信力。如antibodies-online公司就已经开始与独立检验单位Science Exchange 展开合作,为已验证的抗体提供一个特殊的“独立验证”徽章

新的标准开发进程需要时间,目前这一市场是“卖方担保”,但从长期来看,最终抗体有效性的责任还是会落在买方肩上,“科学家们需要能确保他们所使用的每个抗体都经过了验证,”来自洛斯阿拉莫斯国家实验室的分子生物学家Andrew Bradbury说。虽然目前还无法完全做到这一点,The Scientist收集的一些小Tips也许能帮助你发现实验中最灵敏,特异性最强,以及实验可重复的抗体。

了解你所使用的抗体类型

多克隆抗体是对某个抗原产生应答的B细胞分泌的所有免疫球蛋白。为了得到多克隆抗体,第一步是将靶标蛋白注射入动物,一般是兔子,然后收集动物血清,血清中包含有几种结合在靶标蛋白上的抗体,这些抗体亲和力不同,而且也会有一些与抗原无关的抗体。通常针对同一靶标的多个抗体能提升实验中的信号。

如果需要更一致的抗体,那么就要培养单个B细胞,将它们与永生细胞融合形成、杂交瘤细胞系,产生靶向特殊位点的单克隆抗体。从而找到生成目标抗体的培养基,利用细胞系大批量生产单克隆抗体。

然而即使是在单克隆培养体系中,细胞也有可能停止生成抗体,或者抗体基因发生突变,因此Bradbury指出最好是走多一步——通过编码序列的DNA来确定单克隆抗体,而不是通过细胞系来确定。对于那些所谓的重组抗体,目标抗体基因应该来自B细胞,并且通过测序,当然前提是序列已经被公布的。无论细胞系发生了什么,采用了这一DNA或者序列的研究人员都可以得到确定的抗体,科学家们甚至可以调整序列,无需注射动物就能获得新的抗体。

同时制造抗体的抗原也很重要,合成肽段也许能生成适用于Western blot的抗体(蛋白已经发生了变性),相反完整蛋白来源的抗体也许就无法检测出变性了的蛋白。

做好实验前工作

毋庸置疑,实验前首先需要科学文献,检查一下其他研究人员追踪你的兴趣靶标时用的是什么抗体。一些厂家和网站(譬如 antibodypedia.com 和 CiteAb.com )都会列出抗体参考文件。

仔细的翻查这些论文,来自Cell Signaling Technology 公司抗体研发部科学家Anthony Couvillon建议道。看看这些论文是否发表在著名期刊上?作者是否展示了全部Western blots,从中是否能看到其它非特异性条带?他们是否用来合适的对照?

不要以为发表论文中采用最多的抗体就最适合你,挪威奥斯陆大学的蛋白质组学研究专家 Fridtjof Lund-Johansen说。通常每个人使用的都是前人第一次用的那个抗体。
理智选择抗体产品

目前抗体市场上的一大问题就是制造厂商并不一定就是销售方,Proteintech公司创始人与总裁Jason Li说(这家公司只销售自制的抗体)。抗体目录上有这么多的种类,很少有人会去确保每种产品都有效。

为了确保购买有效的抗体,我们需要仔细审查 卖方提供的资料。是否能提供令人信服的数据来确保抗体适合于你的实验?如果需要的是一种修饰后蛋白的特殊抗体,比如乙酰化后的蛋白,那么制造商施法进行了肽段array,针对几种不同的蛋白修饰进行验证。
Couvillon建议检查供应商提供同一靶标的所有产品,如果分子量或者细胞位置在结合同一抗原的抗体之间存在差异,那么就值得怀疑。你可以挑选一些抗体进行尝试,不过值得注意的是,如果你在不同销售商处发现了同样的数据表,那么也许就是打着不同招牌,在卖同样的东西。

自我检测

耶鲁大学医学院的病理学教授David Rimm表示,即使是从信任的厂家那里购买得到的抗体,他也要先自己检测一下。由于之前他曾在一项临床癌症实验中被抗体问题困扰,因此他设计出了一种详细的运算方法来验证抗体

他主要检测的是灵敏度和信噪比,对于Western blot实验来说,抗体应该能在靶标分子量处很好的显示条带,而不是其它;对于免疫组化来说,抗体则能识别蛋白残基出现的组织,而不是其它。对于靶标蛋白表达量高的细胞或组织,抗体也应该能显示出其相应的水平,如果你能接触到不只一种抗体,那么就找出最匹配的抗体来

另外,实验中抗体也应该会与负对照有少量结合,金标准是将抗体用在缺少靶标蛋白的细胞或组织上。2014年Proteintech 尝试利用RNA干扰(RNAi)敲除细胞系中的基因,用以验证他们的抗体。到去年秋天,这家公司已经检测了将近800种抗体(其目录上有12000中抗体)。英国的abcam 公司则采用的是CRISPR 基因编辑技术敲除细胞系来验证抗体,他们计划从2015年年底开始,每年检测300-500种抗体,其公司也已经停售了部分检测失败的抗体。

再次检测

如果找到了一种适合你实验的抗体,那么首先要确保它对于不同的科学家和不同的时间段都是可重复的,然后在每次订购的时候都要进行再次检测。前文所提到的Rimm教授就是因为不同批次的抗体引来了大麻烦:他研发了一种利用抗体的临床检测方法,但是当他几年后订购相同产品的时候,却发现了不同的结果。

这也就是多克隆存在的主要问题:不同批次的放血,或不同的兔子都会产生不同的抗体混合物,这在某种程度上可以通过严格的动物对照来进行控制,比如使用同样培养条件下,同一性别遗传相近的兔子。

按理说,单克隆抗体应该是一种抗体,但这也不能保证多批次就能获得相同的结果。其中部分的原因在于并不是所有的所谓单克隆培养都是来自单一抗体生成血细胞。一些其实是寡克隆(oligoclonal),源自多个抗体生成细胞,其产生的抗体会出现差异。

重组抗体能避免这些情况的发生,但它们也不是完美的,比如不同宿主细胞系也许会形成不同的翻译后修饰,改变其亲和力。甚至培养基中的pH或者氧水平都会影响最终的结果。此外,无论你订购的是哪种类型的抗体,运输途中出现的解冻,都有可能破坏蛋白。

与他人交流

如果你第一次尝试失败的话,不要放弃,打电话给供应商寻求技术支持,一些公司也许会提供新的抗体给你。或者再仔细翻查操作手册,某些抗体也许需要特殊的方法。

如果你找到了一种好的抗体,并发表了论文,那么详细的提供厂家,产品和实验详情能帮助他人更好的复制你的发现。
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