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siRNA表达载体的构建

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RNAi原理

将构建好的siRNA载体转入细胞进行RNAi操作，载体在真核细胞中转录出shRNA（short hairpin RNA），shRNA的loop结构被切除产生siRNA，siRNA的反义链在细胞内与特定蛋白结合形成RISCs（RNA-induced Silencing Complexes）,通过siRNA的反义链与特异mRNA序列互补结合，剪切mRNA导致其降解，从而在细胞内产生基因silencing作用。

siRNA表达载体的构建－－传统模式
1. 选择合适的siRNA表达载体，推荐购买国外知名品牌的。
2. 根据目的mRNA序列，设计RNA干扰靶序列。
3. 根据靶序列设计shRNA，合成每条编码shRNA的两条单链DNA 模板两条单链。大约60bp.
4. 将双链DNA模板退火连接到siRNA表达载体中。
5. 挑选阳性克隆，测序验证序列正确性。

DoGene自我研发的克隆方式适合高通量的siRNA表达载体的构建，每批400个克隆/week。大宗客户将给予的合同价。

服务要求：

1. 以E-mail或传真的方式告知选定的siRNA序列信息，或者告知目的mRNA序列（或NCBI数据库的相关登录号），由我们免费设计siRNA序列；
2. 提供所需克隆的siRNA表达载体和克隆要求，如需阴性对照（Scrambled siRNA）请说明。
3. 构建成功后如需提供转染细胞的无内毒素质粒，请说明浓度及总量要求，价格另议。

4. 价格：请询价!根据您的具体情况商谈；

5. 时间：一般10～15工作日，根据您的要求具体联系。

操作流程：

1. 根据客户提供的SiRNA序列设计克隆方案，如由我们免费设计的SiRNA序列则需客户确认后再设计克隆方案；
2. 构建目的重组载体并测序及制备质粒；
3. 如是常规siRNA表达载体构建，提供质粒（5ug)及菌液（甘油）一份，并附质粒测序报告及质粒酶切电泳图。

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