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蛋白免疫印迹(Western Blotting)

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蛋白免疫印迹概述

印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法(Western Blotting)，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western印迹法既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质表达的最方便也是最通用的一种常规方法。仅去年(2006)一年，维普中文科技期刊数据库收录的采用western blotting方法进行实验研究的文章就有3500多篇。

Western Blotting实验原理

Western印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体(PVDF膜)上，再加抗体形成抗原抗体复合物，并利用发光或显色的原理将结果显示在膜或底片上。

首先，western blotting是要将聚丙烯凝胶电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到膜上，PVDF膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质(10%-20%)。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。电泳印迹法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和PVDF膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到PVDF膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快(15-45 分钟），也是被广为使用。

转移后的PVDF膜就称为一个印迹(blot)，用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如10%的BSA或脱脂奶粉溶液)处理以封闭膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的目标蛋白的抗体(一抗)处理，印迹中只有待研究的蛋白会与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中就只有目标蛋白的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。二抗处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗原抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的目标蛋白的位置。

目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体(二抗)可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的目标蛋白的位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，如荧光素异硫氰酸盐标记的二抗(可通过紫外灯产生荧光)、生物素结合的二抗等
在Western Blotting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。但直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，因此一般情况下都釆用间接法进行检测。

我们的Western实验技术服务流程

客户可以提供抗体，或由我们提供包括抗体在内的所有试剂。

1，蛋白抽提：我们提供组织、细胞等来源样本的蛋白抽提服务，并进行蛋白定量。

2，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

3，蛋白电转到PVDF膜上

4，封闭

5，一抗孵育

6，二抗孵育

7， ECL显色，X光胶片曝光显影。

8，原始数据：目的蛋白的扫描灰度值与内参的灰度值以校正误差，检测结果为目的蛋白的相对

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