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GST融合蛋白分离磁珠|GST-tag蛋白纯化磁珠

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最后更新: 2018-09-09 17:45
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明
 1. 产品描述

 

1.1 产品用途

谷胱甘肽修饰磁珠PuriMag Si-GSH 非常适合用于小型规模的GST标签融合蛋白质纯化。

 

1.2 原理

把含有GST标签的融合蛋白添加到PuriMag Si-GSH磁珠中,在经过短暂的孵育后,重组蛋白将被吸附到磁珠上,然后可使用磁珠分离架把GST融合蛋白洗脱下来。磁分离技术消除了微管的变化、最大限度地减少样品的损失和消除繁杂传统离心方法的步骤,而且适合于自动化操作。

 

1.3 材料的描述

PuriMag Si-GSH磁珠是由还原型谷胱甘肽共价结合在的400nm的超顺磁性微球表面组成,表面二氧化硅层可最大限度降低非特异性蛋白的吸附。磁珠储存在含有20%乙醇的PBS(PH=7.4)中,每1mg磁珠能够吸附超过40ug以上的GST标签融合蛋白。

 

1.4 产品保存

产品能够2-8℃稳定存储,避免冷冻。在存储和所有操作中保证磁珠浸没液体中,干燥的环境会导致吸附量的下降或丧失。使用前应充分悬浮磁珠,避免细菌和真菌污染。

 

2. 操作流程

该说明书以100 μl的 PuriMag Si-GSH磁珠为例,您可根据需要进行放大或者缩小。

 

2.1 细胞破碎液和缓冲液准备

从大肠杆菌细胞中制备含有GST标签的重组蛋白,可采用高压匀浆或超声破碎等方法。

过程所需缓冲液:(1)上样Buffer/洗杂Buffer: 1x PBS pH=7.4 (2)洗脱Buffer: 10mM GSH(还原型谷胱甘肽), 50mM Tris,pH 8.0

 

2.2 使用前准备

1)充分摇匀磁珠。

2)取100μl磁珠到一个干净的管中。

3)把管放置在磁力架上收集磁珠,去上清液。

4)加入1ml 洗杂/上样Buffer充分混匀后,放置在磁力架上收集磁珠,去上清液。重复该次步骤2次。

 

2.3 融合蛋白结合

1)        用100μl的上样Buffer/洗杂Buffer重新悬浮磁珠。

2)        加入含有GST标签重组蛋白的样品轻轻混匀。

3)        放置在振荡器或摇床中在室温下孵育30-60min(如果重组蛋白在室温下不稳定,可以再4℃进行)。

4)        把孵育后的小管放置在磁力架上收集磁珠,去上清液。如果有需要可保留上清,另作检测。

5)        加入1ml 洗杂/上样Buffer充分混匀后,放在磁力架上收集磁珠,去上清。重复该次步骤至少3次。

 

2.4 目的蛋白洗脱

1)        加入100μl洗脱Buffer重新悬浮磁珠,放置在振荡器上室温震荡5min

2)        使用磁力架收集磁珠,把上清转移到另一个干净的管中。

3)        重复步骤1和步骤2.

 

3. 问题解决方法

问题

可能原因

解决方案

GST融合蛋白产量低或无目的蛋白

融合蛋白是以包涵体表达

降低培养温度,把IPTG的浓度减少到10mM,或者适当减少诱导时间;

将表达的包涵体进行适当的变性和重新折迭。

使用的磁珠太少

增加磁珠使用量。

上样样品太少

增加上样样品量。

融合蛋白没有活性

使用更加温和的破碎方法,如加入溶菌酶破碎细胞,防止目的蛋白变性。

融合蛋白降解

在细胞破碎液和洗杂Buffer中加入适量的PMSF

融合蛋白不能有效的洗脱下来

增加洗脱时间或者增加洗脱液的浓度到15mM或更高浓度的谷胱甘肽;

调节洗脱液的PH8.0-9.0

在洗脱Buffer加入Triton X-100(终浓度0.1%)、Noctylglucoside(终浓度2%)或者NaCl(终浓度0.1-0.2M)。

洗脱液中有多个条带.

 

融合蛋白被分解

再细胞破碎液和洗杂Buffer中加入适量的PMSF

一些马的蛋白,如分子伴侣会与GST融合蛋白结合

在洗杂Buffer中加入5mMDTT。将含有目的蛋白破碎液置于chaperonin Buffer2MmATP10mM MgSO450mM Tris-HCl37℃孵育10min,再进行纯化。

超声破碎可能会导致一些蛋白和融合蛋白结合

使用更加温和的破碎条件或者更换破碎方法。

一些蛋白会非特异性结合到融合蛋白或者填料上

优化洗杂条件,加入1% TritonX-100,1% Tween-20,1% CTAB,10mM DTT0.03% SDS0.1%  NP-40。这些试剂能够帮助去除一些非特异性吸附。


更多产品信息请访问官网 http://www.purimagbead.com
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