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高密度氨基磁珠PuriMag G-NH2

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品牌: PuriMag
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发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
所在地: 福建省 厦门
有效期至: 长期有效
最后更新: 2018-09-09 17:45
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明
 一、概述

PuriMag G-NH2氨基磁珠是具有-NH 2表面官能团的超顺磁微球,由Fe3O4核和GMA涂层组成。通过GMA的化学修饰,-NH2基团通过短的亲水性连接臂连接到珠子上。亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性和易操作性。具有表面反应性胺基的磁珠允许配体如蛋白质、肽、碳水化合物或其它特异性分子的固定。配体的固定可以通过醛或酮的还原胺化而不预先活化珠表面。或者,EDC交联剂可用于羧基将配体与胺偶联。最后,胺反应性双功能交联剂可用于引入其他官能团以偶联配体。

PuriMag G-NH2可以用肽、酶、碳水化合物等包被以分离不同的靶标,如激素、受体、凝集素、疾病标志物、噬菌体。一旦与配体结合后,将磁珠加到含目标分子的样品中,短时间孵育后,可通过磁珠亲和捕获靶标。磁分离可除去不需要的上清液,洗涤目标结合的磁珠以得到纯样品。磁珠结合的靶标可直接用于生物测定,并在SDS-PAGE上分析。用常规洗脱方法可将目标分子从磁珠上洗脱下来。

 

二、产品特性

1.       PuriMag GS-NH2

基团密度> 600 umoles amine/g beads

 

2.       PuriMag GL- NH2

基团密度> 300 μmoles amine/g beads

形态:超顺磁球形

直径:200 nm

储存:10 mg/mL ,去离子水中 2~8 °C保存,勿冻结。

常温运输,正确使用保存期一年。

更多氨基磁珠请访问 http://www.purimagbead.com/Product/9314722630.html

方案1. 用于连接醛和酮

含有醛和酮的配体可通过形成Schiff's碱与氨基磁珠偶联,并用氰基硼氢化钠还原胺化。醛基可通过高碘酸钠氧化糖蛋白中的糖残基或多糖中相邻羟基的C-C键的裂解而容易地制备。

 

缓冲液

偶联缓冲液 Coupling Buffer (0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl or 100mM sodium borate, pH9.5 or 100mM sodium citrate, pH9.5);

 5M Sodium Cyanoborohydride in 1M NaOH;

 0.1M Ethanolamine, pH7.4;

 

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。

2. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

3. 从磁力架上取下EP管,加入200μl偶联缓冲液并重悬磁珠。

4. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

5. 用上述缓冲液清洗两次。

 

配体的结合

1. 将配体溶解偶联缓冲液中至浓度1-10 mg/ml。

2. 将适量的配体加入洗过的氨基磁珠并混匀。

3. 每100μl反应混合物中加入1μl的5M氰基硼氢化钠(溶于1M NaOH溶液),室温下孵育2小时。

4. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

5. 加入反应混合物相同体积的0.1M乙醇胺,并在室温下旋转孵育15分钟。

6. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

7. 加入适量的PBS并混匀磁珠。

8. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

9. 重复步骤7-8两次。

 

方案2. 用NHS交联剂活化

最常见的一类活化剂是NH。根据交联剂的性质,可与待固定的配体中的化学基团反应,包括胺、巯基、羧基和羟基以及非选择性光反应。NHS交联剂通常必须在使用前新配。与待固定的配体量相比,使用10倍摩尔过量。

 

缓冲液

偶联缓冲液Coupling Buffer (0.1 M sodium phosphate buffer with 0.15 M NaCl, pH 7.4);

 0.05 M Tris, pH 7;

 

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。

2. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

3. 从磁力架上取下EP管,加入200μl偶联缓冲液并重悬磁珠。

4. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

5. 用上述缓冲液清洗两次。

 

氨基磁珠的活化

1.       用偶联缓冲液重悬氨基磁珠。

注意:避免含有氨基的缓冲液如Tris或甘氨酸,因为它们会与NHS反应竞争。

2. 根据制造商的说明溶解NHS,并将所需体积加入磁珠,混匀。可将水溶性NHS直接加入磁珠中。最终体积应等于小瓶中最初的液体体积。

3. 在室温下孵育30分钟。

4. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。用上面的缓冲液洗两次。

5. 磁珠活化完成。

 

方案2-1. 用-NH2反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

使用同双功能交联剂时,第二个NHS-酯基团将与配体中的-NH2反应,因此通常用于固定肽或蛋白质的N-末端。步骤如下:

1. 重新悬浮活化的氨基磁珠。使用相同的缓冲液将体积调整到所需的磁珠浓度。

2. 加入计算后一定量的配体,混匀。

3. 室温下孵育30分钟或4°C下缓慢倾斜旋转2小时。

4. 孵育后,将试管置于磁铁上2分钟,取出上清液。

5. 加入0.05M 的Tris(pH7)并在室温下温育15分钟以猝灭未反应的活性氨基。

6.用偶联缓冲液洗涤磁珠两次。

方案2-2. 用-SH反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

巯基活性基团通常是吡啶二硫基或碘代/溴代乙酰基。寡核苷酸也可使用马来酰亚胺。适当的缓冲液和孵育条件与巯基反应,配体须含待固定的游离巯基。

1. 重新悬浮活化的磁珠。根据所选的巯基反应基团使用缓冲液(请参见下表)。使用相同的缓冲液将体积调整到所需的磁珠/配体浓度。

2. 加入计算量的游离巯基配体,涡旋混匀。

3. 按下表推荐的时间和温度孵育。

4. 孵育后,可加入半胱氨酸至终浓度为5mM以淬灭未反应基团。室温下孵育15分钟。

5.如所述洗涤偶联的磁珠。

 

SH-reactive group

Recommended buffer

Recommended condition

Maleimide

0.1M sodium phosphate pH 6.5-7.5

4 h at 4℃ or 2 h at room temperature

Iodo/

Bromoacetyl

0.05M sodium borate pH8.3

1h, room temperature. Protect from light.

Pyridyldithio

Phosphate buffered saline (PBS) pH7.5

Over night at room temperature

 

方案2-3. 用光反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

光反应基团如羟苯基迭氮化物、硝基苯迭氮化物、苯迭氮化物或全氟芳基迭氮化物等可与胺基反应。带有光反应基团的交联剂的活化必须在暗室条件下进行。

1. 重新悬浮活化的氨基磁珠。根据活性基团选择缓冲液。用相同缓冲液将体积调整到所需的磁珠/配体浓度。

2. 加入计算后一定量的配体,混匀。

3. 使用推荐的时间、温度、适当波长的光照射。

注意:磁珠可能会熄灭光,因此须优化。

4.将偶联的磁洗两次。

注意:磁珠与DMF等有机溶剂相容,上述活化和偶联均可在干燥有机溶剂中进行。这将消除竞争性水解反应,因此通过延长反应时间可获得更高产率。将磁珠从有机溶剂移至缓冲液之前,用纯水洗涤一次。

 

方案3. 用EDC活化偶联

在配体中不存在其它伯氨基的条件下,通过使用EDC或EDC / NHS(或其他碳化二亚胺)可将磁珠表面的胺基和配体上的羧基偶联。 EDC与羧基反应形成胺反应性中间体。羧基的EDC活化产生非常不稳定的中间体,迅速水解,因此配体需快速添加。或者,可使用NHS的两步法方案来产生较稳定的中间体在较长时间内反应。这两种方法的方案如下。

 

缓冲液

偶联缓冲液Coupling Buffer (0.1M MES Buffer, 0.9% NaCl);

注意:对于使用EDC的偶联反应,避免使用含游离胺或磷酸盐的缓冲液,因为这会干扰偶联效率。Tris,乙酸盐和甘氨酸缓冲液都易与EDC或偶联中间体反应。还应避免含硫醇缓冲液,因为它们不可逆地结合EDC并抑制偶联。

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC);

Sulfo-NHS or N-hydroxysuccinimide (NHS);

封闭缓冲液Quenching Buffer (50mM Tris, pH 8.0 or 5-10mM Hydroxylamine);

PBS;

 

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。

2. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

3. 从磁力架上取下EP管,加入200μl偶联缓冲液并重悬磁珠。

4. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

5. 用上述缓冲液清洗两次。

 

使用NHS进行两步活化偶联

1. 用偶联缓冲液配制50 mg/ml的EDC溶液;用偶联缓冲液配制50 mg/ml的sulfo-NHS或NHS溶液。

注:EDC溶液和NHS溶液应新配,避光保存在冰上。

2. 将60μl的偶联缓冲液、20μl的EDC溶液和20μl的NHS溶液加入洗好的磁珠中,混匀。

3. 在室温下孵育15分钟。

4. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

5. 加入含0.1-3mg/ml抗体或配体的50μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

6. 在室温下倾斜旋转30分钟或在4°C过夜孵育。

7. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

8. 加入100μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

9. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

10. 转到封闭磁珠方案封闭未反应基团。

 

使用EDC一步活化偶联

1. 用偶联缓冲液配制50mg / ml的EDC溶液。

注:EDC溶液应新配,避光保存在冰上。

2. 加入含有0.1〜3mg/ml抗体或配体的50μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

3. 将60μl的偶联缓冲液和20μl的EDC溶液加入洗好磁珠中,混匀。

4. 在室温下孵育30分钟。

5. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

6. 加入100μl的偶联缓冲液并重悬磁珠。

7. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

8. 重复步骤6〜7两次。

9. 转到封闭磁珠方案封闭未反应基团。

 

封闭磁珠

1. 加入500μl封闭缓冲液并重悬磁珠。

2. 在室温下孵育30分钟。

3. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

4. 加入500μl封闭缓冲液并重悬磁珠。

5. 将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。

6. 加入500μL的PBS,pH7.4(或优选的缓冲液)并重悬磁珠。将EP管置于磁力架上60秒,并吸弃上清液。重复洗涤两次。

7. 加入100μL的PBS,pH7.4(或优选的缓冲液)并重悬磁珠,4°C储存。

 

附录1:免疫共沉淀分析

1. 将至少100μl含有靶抗原的细胞裂解物样品加入到来自步骤7的磁珠管中并涡旋10秒。

2. 室温孵育30分钟或4°C过夜,轻轻摇动。

3. 将试管置于磁力架上60秒,弃去上清液,然后从磁力架上取下试管。

4. 加入200μl洗涤缓冲液并重新悬浮磁珠。将试管置于磁力架上60秒,弃去上清液,然后从磁力架上取下EP管。再洗两次去除未结合的抗原。

5. 采用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液并在95°C加热磁珠5分钟。将磁珠/上样缓冲液混合物直接加到SDS-PAGE凝胶上,并按正常进行电泳和印迹。

 

抗体和抗原的排除

1. 向磁珠、抗体、抗原混合物中加入20μl洗脱缓冲液并重悬磁珠。

2. 在室温下孵育2分钟。

3. 将EP管放在磁力架上60秒。

4. 将上清液收集到干净的EP管中,然后加入2μl中和缓冲液(例如1M Tris-HCl,pH8.5)调节pH。

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